分子神経変性 18 巻、記事番号: 8 (2023) この記事を引用
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この記事の訂正は 2023 年 4 月 28 日に公開されました
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TREM2 (骨髄細胞上で発現されるトリガー受容体 2) の稀な p.H157Y 変異体が、アルツハイマー病 (AD) のリスクを高めることが判明しました。 この変異は、TREM2 細胞外ドメインの切断部位に位置します。 HEK293 細胞における TREM2-H157Y の異所性発現は、TREM2 脱落の増加をもたらしました。 ただし、TREM2 H157Y 変異の生理学的結果は、AD 関連の病状の有無にかかわらず不明のままです。
私たちは、CRISPR/Cas9 技術を通じて新しい Trem2 H157Y ノックイン マウス モデルを生成し、生化学的アッセイ、TREM2、海馬の標的質量分析を行うことにより、TREM2 タンパク質分解プロセシング、シナプス機能、および AD 関連のアミロイド病態に対する Trem2 H157Y の効果を調査しました。電気生理学、免疫蛍光染色、生体内微量透析、および皮質バルク RNA シーケンス。
以前の in vitro 所見と一致して、Trem2 H157Y は、脳および血清中の可溶性 TREM2 レベルを上昇させ、TREM2 脱落を増加させます。 さらに、Trem2 H157Y は、ミクログリアの密度や形態、あるいは TREM2 シグナル伝達に影響を与えることなく、シナプス可塑性を強化します。 アミロイド病理の存在下では、Trem2 H157Y は 2 つの独立した創始株においてアミロイド β (Aβ) クリアランスを加速し、アミロイド負荷、ジストロフィー性神経突起、および神経膠症を軽減します。 TREM2 の標的質量分析により、野生型 TREM2 と比較して可溶性 TREM2-H157Y と全長 TREM2-H157Y の比率が高いことが明らかになり、H157Y 変異が Aβ の存在下で TREM2 脱落を促進することが示されました。 Trem2 H157Y ホモ接合マウスでは TREM2 シグナル伝達が減少していることがさらにわかりました。 トランスクリプトームプロファイリングにより、Trem2 H157Y が神経炎症関連遺伝子および免疫モジュールを下方制御し、アミロイド病理と相関していることが明らかになりました。
総合すると、我々の発見は、シナプス機能およびアミロイド病理の軽減における Trem2 H157Y 変異の有益な効果を示唆しています。 TREM2 p.H157Y と AD リスクとの遺伝的関連を考慮すると、ヒトにおける TREM2 H157Y は、さらなる研究に値するタウオパチーや神経変性に対する効果など、アミロイド非依存性経路を通じて AD リスクを増加させる可能性があると推測されます。
アルツハイマー病 (AD) は、細胞外アミロイド斑とニューロン内の過剰リン酸化タウもつれの病理学的沈着、および神経病理と神経変性に反応する顕著なミクログリア活性化を特徴とする慢性神経変性疾患です [1、2、3]。 複数のミクログリア遺伝子変異体がアルツハイマー病のリスクと関連していることがわかっています[4]。 その中で、骨髄細胞 2 上で発現したトリガー受容体 (TREM2) の p.H157Y 変異体は、比較的少数の保因者から同定され、オッズ比 (OR) 11.01 (マイナー対立遺伝子頻度 (MAF)) で AD リスクの増加をもたらしました。 、0.4%）漢民族コホートでは[5]、一方、アルツハイマー病配列決定プロジェクトで使用された白人コホートでは、ORは4.7（MAF、0.06%）でした[6]。 しかし、このまれな TREM2 変異体がどのように AD リスクに寄与するかは明らかではありません。
TREM2 は、中枢神経系のミクログリアと末梢の骨髄細胞 (マクロファージなど) でのみ発現する免疫受容体です [7]。 これは、Ig 様 V 型ドメイン、ストーク領域、膜貫通ドメイン、および短い細胞質尾部から構成されます [8]。 TREM2 のほとんどの AD リスク変異体 (p.R47H、p.R62H) は、Ig 様ドメインをコードするエクソン 2 に位置しています [9、10、11]。 これらの病原性変異は主に、アミロイド β (Aβ) オリゴマー [12、13、14]、線維状 Aβ 関連アニオン性脂質 [15]、LDL [6、16]、HDL [6]、およびアポリポタンパク質 [16、17]。 これらの障害は、in vitro での食作用におけるミクログリアの機能不全 [16、18、19] および in vivo でのアミロイド斑の貪食 [20、21] に関連しています。 対照的に、p.H157Y バリアントはストーク領域をコードするエクソン 3 に位置しています。 興味深いことに、H157-S158 部位は、可溶性 TREM2 (sTREM2) が生成される ADAM10/17 切断部位として同定されました [22、23、24]。 HEK293 細胞における TREM2-H157Y の異所性発現は、馴化培地中で sTREM2 を増加させ、膜に結合した成熟全長 TREM2 を減少させることが判明しました [23、24]。 TREM2 脱落の増加は、HEK293 細胞における pHrodo-E.Coli の貪食作用の障害 [23]、および 2B4 T 細胞におけるホスファチジルセリンに応答した TREM2 シグナル伝達活性化の減少に関連している可能性があります [6]。 これらの in vitro 観察にもかかわらず、TREM2 H157Y 変異の in vivo での影響は依然として不明です。
8 µm [32, 33]) numbers divided by the ROI areas. For IBA1 staining in the non-amyloid mice, a unified intensity threshold was applied to recognize the microglial cell body followed by particle analysis to examine the microglial density and cell body size. To further assess microglial morphology, 4–5 fields were taken per sample under confocal (Zeiss) at 20 × with a zoom factor 0.6. Images were processed to remove background and skeletonized followed by analysis of branch number, junction number and total branch length per microglia [34]./p> 0.25. Hierarchical clustering was performed in MATLAB using the Clustergram function based on standardized Euclidean distance metric. Volcano plots were generated in MATLAB using –log10 (FDR) as y axis and ± log2 (|FC|) as x axis. Pathway analyses of differentially expressed genes were performed through Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN Inc., https://digitalinsights.qiagen.com/products/ingenuity-pathwayanalysis) [48]./p> 2 suggests moderate preservation and Z summary score > 10 suggests strong preservation./p> T substitution in exon3 through CRISPR/Cas9 technology to create the missense H157Y mutation (Fig. 1A). Two founders (1 and 2) were obtained with no off-target mutation observed in the offspring from either founder (Fig. S1A-B). Results reported below were generated using the offspring of founder 1 unless otherwise stated. By crossing the Trem2 H157Y heterozygous mice, we obtained three genotypes: wild type (Trem2+/+, referred to as WT), heterozygous (Trem2+/H157Y, referred to as Het), and homozygous (Trem2H157Y/H157Y, referred to as Hom). Littermates of these three genotypes were used to investigate the impacts of the Trem2 H157Y mutation on TREM2 proteolytic processing, microglial density and morphology, synaptic plasticity, and cognitive function./p> T mutation (bold orange) via CRIPR/Cas9. Protospacer region recognized by guide RNA (gRNA) is shown in orange. Protospacer adjacent region (PAM) is indicated in green. B-C. Cortical Trem2 mRNA levels were examined using primers targeting exon 2 (N-terminal, B) or exon 4–5 (C-terminal, C), and normalized to WT mice for each genotype. D. Cycle threshold ratios of C-terminal Trem2 to N-terminal Trem2 (C/N Trem2) were calculated and normalized to WT mice for each genotype. E–F. TREM2 levels were examined by ELISA and normalized to WT mice in cortical TBS (E) and TBSX (F) lysates for each genotype. G-H. TREM2 levels were examined by ELISA in conditioned medium (CM) (G) and RIPA lysates (H) of primary microglia (MG). TREM2 amount was normalized to the total protein level of cell lysates followed by another normalization to WT littermates. N = 8–11 pups per genotype. Unknown sex of each pup. I. Serum TREM2 were examined by ELISA in mice from each genotype. J. SYK, phosphorylated SYK (pSYK) and actin were detected in the RIPA lysates of isolated microglia from WT and Hom mice. K-L. pSYK (K) and SYK (L) were quantified and normalized to WT. M. Ratios of pSYK/SYK were calculated and normalized to the WT mice. B-F, I. N = 11–14 mice per genotype at 6 months of age, mixed sex. Kruskal–Wallis tests with uncorrected Dun’s multiple comparisons were used in B-I. J-M. N = 6 mice/genotype at 6 months of age, mixed sex. Unpaired t-tests were used. Data are presented as Mean ± SEM. N.S., not significant. * p < 0.05. **p < 0.01/p> 1.2; FDR< 0.05) were identified and indicated in red or blue in the volcano plot. B. Hierarchical clustering for DEG expression (Hom vs WT) is shown across each sample. DEGs involved in the top 10 pathways (C) are shown in blue. C. Top 10 DEG related pathways were identified through Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Red dashed line indicates the FDR threshold, 0.05. D. Weighted gene co-expression network analysis (WGCNA) identified a unique magenta module which is downregulated in Hom and correlated with amyloid pathological readouts. E. Magenta module eigengenes (ME) were compared between WT and Hom mice. Data are presented as Mean ± SEM. Wilcoxon rank sum test was used. F. Top 10 gene ontology (GO) terms (FDR < 0.05) are shown for the magenta module. G. Network plot of genes involved in the top 10 GO terms was generated through Cytoscape. H. TNF-α in the TBS lysate was quantified and normalized to WT mice for each genotype. N = 19–24 mice per genotype at 8.5 months of age, mixed sex. Data are presented as Mean ± SEM. Kruskal–Wallis tests with uncorrected Dun’s multiple comparisons were used. * p < 0.05. **p < 0.01/p>
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